本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种超分子生物分子纳米粒子及其合成的方法和应用。
背景技术：
生物分子诸如核酸或核酸适配体在癌症的诊断或治疗中起着重大的作用，基于生物分子的诸多优良功能，研究者将其与许多合成分子或元素进行偶联，例如：生色团、脂类金属有机配合物、分子纳米粒子等。偶联物因此具备功能性生物分子与合成分子的优良特性的结合，使其在传感、蛋白活性调控、细胞行为调控、生物医学等方面有了较多的应用可能。先前我们曾报道了生物分子(dna、rna等)与分子纳米粒子偶联而成的均质型生物分子纳米粒子。分子纳米粒子是一类具有刚性结构的分子，其大小在纳米级别。分子纳米粒子的结构十分优异，因为其核结构是确定的，表面的官能团位点也是确定的，通过一定的化学处理可以对其表面的官能团进行定向修饰。分子纳米粒子相较于经典的无机纳米粒子，具有结构精确，官能团的数量、种类、位置也可精确调控等优点。目前广泛研究的分子纳米粒子主要有富勒烯、多面体笼型倍半硅氧烷、金属杂多酸、环糊精等。
上述提及的环糊精与其他几种分子纳米粒子相比，其有独特的空腔结构，此空腔使其可与疏水客体利用超分子化学进行主客体自组装而成为超分子。超分子化学，也被称为“超越分子的化学”，自1978年jean-marielehn正式提出超分子的概念及相关规范术语以来，超分子化学一直是人们研究的热点之一，与传统化学对共价键的研究不同，超分子化学主要研究的是非共价相互作用，即分子间作用力，包括疏水作用、氢键、范德华力、静电相互作用、金属配位、形状或尺寸匹配等。在各种非共价相互作用中，β-环糊精(β-cd)与金刚烷之间的主客体相互作用由于具有较高的结合常数(ka＝104–105m-1)被广泛地用于设计各种功能性纳米结构。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种可以通过内吞作用进细胞成像且可以更好的进行基因调控的超分子生物分子纳米粒子合成的方法。
本发明的一种超分子生物分子纳米粒子合成的方法，包括如下步骤：
s1：采用无铜催化的点击化学法，将叠氮修饰β-环糊精与3'端修饰dbco的dna反应得均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子；
s2：将氨基修饰的核酸适配体与含盐酸盐的金刚烷混合放置在摇床上反应得核酸适配体功能化的金刚烷；
s3：将均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子与核酸适配体功能化的金刚烷在室温下混合，震荡混匀得超分子生物分子纳米粒子；
其中，步骤s1和s2无先后顺序。
进一步的，所述核酸适配体包括但不限于as1411。
进一步的，步骤s1中将摩尔比为1:10.5的叠氮修饰β-环糊精与3'端修饰dbco的dna在温度25℃，摇床摇速1000rpm条件下反应5h得均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子。
进一步的，步骤s1中使用高效液相色谱法对产物进行分离，最后通过质谱法确定均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子的合成。
进一步的，步骤s2中使用高效液相色谱法对产物进行分离，最后通过质谱法确定客体核酸适配体功能化的金刚烷。
进一步的，步骤s3中均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子与核酸适配体功能化的金刚烷的摩尔比为1:1。
如上述的一种超分子生物分子纳米粒子合成的方法合成的超分子生物分子纳米粒子。
上述的超分子生物分子纳米粒子应用于细胞成像。
本发明利用环糊精与金刚烷结合常数较高的超分子化学作用，在均质型β-环糊精基dna分子纳米粒子的基础上，自组装核酸适配体功能化的金刚烷，升级到超分子生物分子纳米粒子，另外，环糊精与金刚烷均偶联有不同的功能性核酸适配体，结合起来不仅可以通过内吞作用进细胞成像且可以更好的进行基因调控。
附图说明
图1为实施例1的客体ada-as1411液相色谱分离结果图；
图2为实施例1的客体ada-as1411的金刚烷的质谱表征图；
图3a为实施例1的对比组的主体与客体自组装荧光法表征图；
图3b为实施例1的主体与客体自组装荧光法表征图；
图4为实施例1的均质型生物分子纳米粒子及超分子纳米粒子细胞成像图；
图5为实施例1的均质型生物分子纳米粒子细胞摄取随时间变化谱图；
图6为实施例1的超分子生物分子纳米粒子细胞摄取随时间变化谱图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
一、客体ada-as1411的合成
取100μl溶于dmso的3.6μm的金刚烷与100μl浓度为0.1μm的核酸适配体as1411进行混合，在温度50℃，摇床摇速1000rpm条件下反应4h。as1411的序列表为tttctccatggtgctcac。
二、客体ada-as1411的hplc分离
1、流动相的配制：a相为有机相(80％mecn(乙腈))+20％teaa)，b相为水相(teaa,ph≈7.0)。teaa溶液由5.6ml冰醋酸与13.86ml三乙胺混合，加入超纯水至体积为1000ml配制，用ph计调节ph至约7.0；
2、对参比样的谱图进行采集
3、用相同的条件对产物样进行分离纯化
4、对纯化后的产物进行谱图采集
结果表明：未分离的产物在色谱图(见图1)上有多余的原料的峰以及目标产物的峰。
三、客体ada-as1411的eis-ms表征
1、将hplc收集的产物用浓缩机浓缩，除去流动相；
2、送生工进行质谱检测(结果见图2)。
结果表明：目标物客体ada-as1411的分子量分别为8615.9，与预估的理论分子量一致，证明客体部分合成成功。
四、超生物分子纳米粒子主体与客体自组装荧光法表征
1、500nme33(dna浓度7μm)的配制：取50μl浓度为1μm的e33(dna浓度7μm)于离心管中，加入50μl的超纯水稀释至e33浓度为500nm(dna浓度3.5μm)
2、将cy5荧光基团修饰的客体ada用紫外定浓度为10μm
3、用荧光光谱仪分别扫描含有cy3修饰的主体和cy5修饰的客体，确定下两者的激发波长和发射波长分别为ex：532nm、em：566nm；ex：640nm、em：661nm
4、在ex为532nm下，用荧光光谱仪扫描500nme33(cy3修饰的主体)谱图，然后加入采用不断滴加10μmada-cy5(cy5修饰的客体)，分别扫描加入的客体的浓度至0.05μm、0.10μm、0.15μm、0.20μm、0.25μm、0.30μm、0.35μm、0.40μm、0.45μm、0.50μm、0.55μm、0.60μm、0.70μm、0.80μm、0.90μm、1.00μm时的荧光谱图，以观察是否有荧光能量的转移；
5、在上述相同的条件下，对cy3修饰的主体上所用的等浓度等体积原料(单链)dna与客体进行扫描以做对照，来观察没有环糊精空腔存在下是否有荧光能量转移。
产物见图3a，对比组见图3b，结果表明：没有环糊精存在下的cy3与cy5谱图随时间和浓度基本都没有变化，即不能发生荧光共振能量转移；环糊精存在下，随客体的不断加入，cy3的荧光能量逐渐转入cy5。两者对比说明，环糊精存在下，金刚烷与环糊精进行超分子之主客体自组装引起cy3与cy5靠近从而引发荧光能量的共振转移。
五、β-环糊精基dna分子纳米粒子及超分子生物分子纳米粒子细胞成像研究
1、超分子dna分子纳米粒子的合成：将β-环糊精基dna分子纳米粒子与核酸功能化的金刚烷(本实施例的序列号为ggtggtggtggttgtggtggtggtgg)以1:1(n:n)在室温下混合，震荡混匀。
2、mcf-7细胞的培养：细胞传代后分皿，37℃，5％co2下用培养基正常培养细胞(密度约5.0×105cells/well)至较好贴壁。
3、样品药物的孵育：细胞培养之后，吸出培养基，换用含有相同浓度样品(e33、freedna、e33-ada-aptamer)的无血清培养基孵育细胞6h。
4、对于合成样品e33、e33-ada-aptamer同时进行1h，3h的孵育，来观察不同时间段下细胞对样品的摄取程度以及相同时间下不同样品摄取情况的比较。e33-ada-aptamer另外进行24h下摄取情况的观察。
5、共聚焦对细胞摄取的测定：孵育完成之后，加入5μl活细胞核染色液hoechest33258染色20min，之后去除培养基，用1mlpbs洗涤细胞三次，并立即在共聚焦激光扫描显微镜上以405nm(hoechest)和543nm(cy3)的激发波长成像。未处理的细胞作为大阴性对照。对于所有样品，成像设置保持相同。(结果见图4-6)
结果表明：dmem作为大阴性对照，没有任何摄取；freedna基本不能进入细胞；β-环糊精基dna分子纳米粒子和超分子dna分子纳米粒子能够进入细胞以进行细胞成像。
e33、e33-ada-aptamer随孵育时间的增加，被细胞所摄取的程度也不断增加。
以上未涉及之处，适用于现有技术。
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。