背景技术：
癌症是当前危害人类健康和生命的重大疾病之一。根据世界卫生组织下属的国际癌症中心(iarc)发布的《2014世界癌症报告》，2012年有1400万人被诊断为癌症。据估计，到2025年，全球每年新增患癌病例将增至1900万，到2023年将增至2200万，到2035年将增至2400万，即未来20年，癌症病例将增加五成。报告数据显示，我国癌症新增病例和死亡病例位居全球之冠。
2015年10月9日，全国肿瘤防治研究办公室、国家癌症中心主任陈万青带领团队在国际著名癌症专业期刊《癌症通讯》(cancerletters)上首次发布我国居民癌症现患数据。结果显示，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万(其中男性患者368万人，女性患者381万人)，总体5年癌症患病率为556/10万。与发病率相比，5年患病率更能从整体上反映疾病负担。研究表明，结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌、女性乳腺癌5种常见癌占总数一半。
在2011年3月出版的cell杂志上，douglashanahan和roberta.weinberg发表了一篇综述：hallmarksofcancer：thenextgeneration，介绍了肿瘤细胞的十大基本特征：自给自足生长信号；抗生长信号的不敏感；抵抗细胞死亡；潜力无限的复制能力；持续的血管生成；组织浸润和转移；避免免疫摧毁；促进肿瘤的炎症；细胞能量异常；基因组不稳定和突变。因此，化合物的抗增殖作用，对细胞周期、凋亡过程的影响，对肿瘤扩散、转移的抑制作用等常用来研究其抗肿瘤活性。
经研究，一类以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物在肿瘤治疗方面具有很好的药效，尤其是化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)，并且至今为止，没有任何关于化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)在肿瘤治疗方面的药效研究。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一类以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物及其筛选方法与应用。
本发明的目的在于提供一类以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物。
本发明的另一目的，还在于提供以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物在肿瘤治疗方面的应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明通过如下筛选方法获得的一类以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物：首先对chemdiv化合物库中的化合物进行优化，包括去重、能量优化及lipinski五原则等；其次优化后的化合物使用基于机器学习的抗癌细胞化合物活性理论预测模型(nci-60predictor)中的nb_lcfp_6和nb_fcfp_8模型进行虚拟筛选；然后再结合一致性打分、聚类分析、骨架多样性分析及经验筛选等方法，遴选出44个候选苗头化合物；最后采用细胞毒性(mtt)实验验证各苗头化合物的活性，发现化合物h2并以其骨架吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮作为第二轮虚拟筛选的起始结构，以此采用基于ecpf_4指纹的相似度搜索、骨架多样性分析及经验筛选等方法，遴选出61个h2的衍生物；然后采用mtt细胞毒性实验验证各苗头化合物的活性，其中化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)活性较好。筛选流程如图1所示。
本发明提供的一种以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物，结构式为
其中，r1为2-(3-氯-苯基)-5-甲基-呋喃、3-甲基噻吩、2-甲基噻吩、1,4,5-三甲基-1h-吡唑、4-甲基苯甲酸、对甲酚、1-甲氧基-4-甲基苯、1,2-二甲氧基-4-甲基苯、1,2-二甲氧基-3-甲基苯、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯、5-甲基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯及2,6-二甲氧基苯酚等中的一种的取代基；
其中，r2为2,3-二甲基噻吩、1-乙基-3,4-二甲基-1h-吡唑、1-乙基-4-甲基-1h-吡唑、1-乙基-4,5-二甲基-1h-吡唑、2,3-二甲基苯并[b]噻吩、4-甲基苄氰、甲基4-甲基苯甲酸酯、1-氟-4-((对甲苯氧基)甲基)苯、4-甲基吡啶、2-甲氧基-5-甲基苯酚、1-二氮烯基-2-(2-甲氧基-4-甲基苯氧基)乙-1-酮、2-甲氧基-4-甲基苯酚及3-甲基吡啶等中的一种的取代基。
一种以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物，其具有如上述的结构，或为上述结构的立体异构体、水合物、溶剂化物及药学上可接受的盐或前药。
进一步地，所述r1的结构式为
其中，r3、r4和r5各自独立地选自氢、甲氧基、羟基或甲酸基。
进一步地，所述r2的结构式为
其中，a选自h或-ch3；r6选自氰基、甲酸甲酯基或(4-氟-苯基)-甲氧基；r7和r8各自独立地选自甲氧基、羟基或羟基乙酰胺基。
进一步地，所述的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物，其结构可以为
(1)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)；
(2)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(噻吩-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h2)；
(3)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(噻吩-2-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h1)；
(4)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1,5-二甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h4)；
(5)(s)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苯甲酸(g4)；
(6)(s)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苯甲酸(b4)；
(7)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(a8)；
(8)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(3,4-二甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b2)；
(9)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(2,3-二甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(a7)；
(10)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b5)；
(11)(s)-4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b8)；
(12)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h2)；
(13)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(3-甲基噻吩-2-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(g8)；
(14)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5，7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h5)；
(15)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h6)；
(16)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h7)；
(17)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(2-甲基苯并[b]噻吩-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h3)；
(18)(r)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苄氰(g6)；
(19)(r)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑甲基[3,4]-b]吡啶-4-基)苯甲酸甲酯(g5)；
(20)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b1)；
(21)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(吡啶-4-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(i1)；
(22)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b7)；
(23)(r)-2-(4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酰胺(b6)；
(24)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b3)；
(25)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(吡啶-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(h8)等中的一种或以上结构的立体异构体、几何异构体、消旋体、溶剂化物、药学上可接受的盐及药学上可接受的前药。
优选地，本发明提供的化合物为(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮，即化合物i2。
本发明提供一种药物组合物，包含所述的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物、药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂及媒介物中的一种以上。
本发明提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物能够应用于制备用于治疗、预防或辅助治疗秋水仙素位点作用的增殖性疾病的药品。
本发明提供的药物组合物能够应用于制备用于治疗、预防或辅助治疗秋水仙素位点作用的增殖性疾病的药品。
进一步地，所述增殖性疾病包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、宫颈癌、cns的癌症、恶性胶质瘤或骨髓增生病、白血病或淋巴癌。
本发明提供一种筛选上述以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物的方法，包括如下步骤：
(1)对chemdiv化合物库(1737238个化合物)进行去除重复、能量优化及lipinski五原则筛选后得到优化后的化合物库(1294946个化合物)；
(2)运用nci-60活性预测模型中的两种理论模型nb_lcfp_6和nb_fcfp_8对优化后的化合物库中的化合物进行活性预测，得到活性化合物(18522个化合物)；
(3)对所述活性化合物进行admet性质及一致性的打分筛选，得到筛选后的化合物(1376个化合物)；
(4)通过骨架多样性分析与经验筛选对所述筛选后的化合物进一步筛选，得到进一步筛选的化合物(44个化合物)；
(5)对所述进一步筛选的化合物进行mtt测试，得到化合物h2，即所述以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物；
(6)以化合物h2的骨架吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为起始结构，采用相似度搜索、骨架多样性分析及经验筛选的方法对chemdiv化合物库再次筛选得到其61个衍生物；对61个化合物进行mtt测试，最终得到符合要求的化合物(共25个)，其中化合物i2活性较好。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物，对多种肿瘤细胞系均具有抗肿瘤活性，对肿瘤细胞微管影响明显，能够阻滞mda-mb-231等细胞的细胞周期于g2/m期，诱导细胞凋亡。
附图说明
图1为本发明提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物的虚拟筛选流程图；
图2为化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)与微管蛋白进行分子对接的结果图；
图3为化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞微管稳定性影响的结果图；
图4为化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞系周期影响的结果图；
图5为化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞系凋亡阶段影响的分布图及凋亡蛋白通路图；
图6为化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)在体外对微管蛋白影响的结果图；
图7为i2与秋水仙碱对mda-mb-231细胞中ebi抑制β-微管蛋白的cys239和cys354的双硫代烷基化的影响效果图；
图8为对图7中蛋白条带灰度值的定量分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种筛选以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物的方法(可参照图1)，包括如下步骤：
(1)对chemdiv化合物库(1737238个化合物)进行去除重复、能量优化及lipinski五原则后得到优化后的化合物库(1294946个化合物)；
(2)运用nci-60活性预测模型中的两种理论模型nb_lcfp_6和nb_fcfp_8对优化后的化合物库中的化合物进行活性预测，得到活性化合物(18522个化合物)；
(3)对所述活性化合物进行admet性质及一致性的打分筛选，得到筛选后的化合物(1376个化合物)；
(4)通过骨架多样性分析与经验筛选对所述筛选后的化合物进一步筛选，得到进一步筛选的化合物(44个化合物)；
(5)对所述进一步筛选的化合物进行mtt测试，得到化合物h2，即所述以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物；
(6)以化合物h2的骨架吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为起始结构，采用相似度搜索、骨架多样性分析及经验筛选的方法对chemdiv化合物库再次筛选得到其61个衍生物；对61个化合物进行mtt测试，最终得到24个符合要求的化合物，其中化合物i2活性较好。
筛选得到的25个化合物(以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物)，其结构分别如下所示：
(1)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)；
(2)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(噻吩-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h2)；
(3)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(噻吩-2-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h1)；
(4)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1,5-二甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h4)；
(5)(s)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苯甲酸(g4)；
(6)(s)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苯甲酸(b4)；
(7)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(a8)；
(8)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(3,4-二甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b2)；
(9)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(2,3-二甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(a7)；
(10)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b5)；
(11)(s)-4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b8)；
(12)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(3-甲基噻吩-2-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(g8)；
(13)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-3-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5，7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h5)；
(14)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h6)；
(15)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(1-乙基-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h7)；
(16)(s)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(2-甲基苯并[b]噻吩-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(h3)；
(17)(r)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)苄氰(g6)；
(18)(r)-4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑甲基[3,4]-b]吡啶-4-基)苯甲酸甲酯(g5)；
(19)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-((4-氟苄基)氧基)苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b1)；
(20)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(吡啶-4-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(i1)；
(21)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b7)；
(22)(r)-2-(4-(1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-6-氧代-4,5,6,7-四氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)-2-甲氧基苯氧基)乙酰胺(b6)；
(23)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(b3)；
(24)(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-3-甲基-4-(吡啶-3-基)-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑[3,4-b]吡啶-6-酮(h8)。
实施例2
取化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)与微管蛋白进行分子对接实验。其他筛选得到的化合物效果与化合物(i2)相似，可参照化合物(i2)。
该实验，包括如下步骤：
(1)从pdb数据库检索到结合有秋水仙碱的微管蛋白(4o2b)的x射线晶体结构；
(2)对微管蛋白进行去除水分子、金属离子、秋水仙碱、gtp、gdp、acp和蛋白c、d与e链均被删除以及质子化的处理；
(3)对化合物i2进行设置力场等处理并保存为sdf格式；
(4)使用ds3.5中的cdocker程序设置结合位点以秋水仙碱配体为中心的球体(x＝16.98，y＝66.23，z＝42.76)，半径为其他cdocker参数设置为默认值；
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)在微管蛋白秋水仙素结合位点原子水平上的二维和三维结合模式如图2所示(图2的1部分表示二维结合模式，图2的2部分表示三维结合模式)。i2的2-(3-氯苯基)呋喃被β-微管蛋白的ala354、leu248、ala317、leu242、leu255、ile378、lys352和ile318包围，表明i2与这些残基形成疏水相互作用。苯并咪唑取代基与t7环的gln247和leu248相互作用，吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮骨架位于β-微管蛋白t7环和α-微管蛋白t5环之间，以支持i2的活性构象。图2显示i2与β-微管蛋白的gln247、leu248和ala316相互作用，另外，i2与asn249的侧链形成一个氢键。
实施例3
对实施例1提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物进行mtt实验。
该实验包括如下步骤：
(1)铺板：取对数生长期的mda-mb-231、hela、mcf-7、hepg2、cne2以及hct116细胞系，按3500个/孔铺于96孔板中，每孔100μl细胞悬液；
(2)加药：贴壁24h后，小心吸走原有培养基，加入100μl一定浓度梯度实施例1化合物制得的工作液。设加药组、对照组、空白组；
用培养基将实施例1提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物稀释成100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、以及3.125μm，最高浓度不超过100μm；对照组加入空白培养基；空白组为不含细胞组对照；
(3)孵育：在条件为体积分数5％co2、37℃的培养箱内孵育48h；
(4)加mtt(噻唑蓝)：按每孔20μl加入mtt(2.5mg/ml)，避光放入培养箱中培养4h；
(5)二甲基亚砜(dmso)溶解：弃去上层液体，留下紫色结晶；按每孔120μl加入dmso溶解结晶，置摇床上低速振荡20min，使结晶溶解，避光；
(6)检测：用酶标仪检测490nm处od值，用graphpadprism5.0处理数据。
通过mtt实验，观察实施例1提供的以吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮为骨架的新型抗肿瘤先导化合物对mda-mb-231、hela、mcf-7、hepg2、cne2以及hct116细胞系六种肿瘤细胞系的影响，其ic50结果如表1所示。
由表1可知，实施例1所述的化合物对hela、mcf-7、mda-mb-231、hct116、cne2以及hepg2细胞系具有较好的抗肿瘤活性，其中化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对六种细胞系均有较好的抑制活性，并且ic50在3.0-5.8μm之间。mtt实验表明，化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性较好。
表1
a表示在三次独立实验测得实验的平均值及每次实验的标准差；nd:notdetermined(不能确定)。
实施例4
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)进行免疫荧光实验。
该实验包括如下步骤：
(1)铺板：取对数生长期的mda-mb-231细胞系细胞，以占24孔板每孔底50％的密度铺板；
(2)加药：待细胞孵育12h贴壁后，用培养基将化合物i2稀释成2.5μm、5μm以及10μm加药，溶剂对照组给空白培养基，阳性对照组给10μm秋水仙素；
(3)孵育：在条件为体积分数5％co2、37℃的培养箱内孵育12h；
(4)到时间点后，置于冰水浴上处理5min，倒掉培养基，用常温的pbs缓冲液洗两次；常温组则是直接倒掉培养基，然后用pbs缓冲液快洗两次；加入500μlpemtbuffer(100mmpipes，1mmegta，1mmmgso4，0.5wt％tritonx-100，ph6.8)，作用2min，倒掉；用pembuffer快速洗2次；
(5)固定、通透：每孔400μl冰甲醇，通透5min；
(6)封闭：用pbs缓冲液配置质量分数为2.5％的bsa溶液，并以11000rpm离心10min，每孔300μl质量分数为2.5％的bsa溶液室温封闭30min；
(7)孵育一抗：以1:800比例稀释(β-tubulin，用质量分数为2.5％的bsa溶液稀释)，4℃摇床上孵育12h；
(8)用pbst洗玻片，洗5次，每次6min；
(9)孵育二抗：以1:800比例稀释(anti-mouseigg(h+l)，用质量分数为2.5％的bsa溶液稀释)，室温静置2h，避光操作；
(10)用pbst洗玻片，洗5-6次，每次10min；
(11)dapi染核(凯基-试剂盒kga215，用pbs稀释15倍)；室温条件下静置，染色时间为6min，整个过程是避光操作；
(12)洗去dapi，用pbst(含体积分数为5‰tritonx100的pbs)洗涤爬片，5min×5次；
(13)封片：用防荧光淬灭封片剂封片。封片时细胞面向下，尽量避免产生气泡；
(14)激光共聚焦显微镜扫描拍摄，63倍，油镜。
通过免疫荧光实验可知化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞的微管具有显著的影响。
图3为i2对mda-mb-231细胞微管稳定性影响的结果图。由图3可知，与对照组相比，室温下未处理细胞的微管以有序的方式展开并朝向细胞边缘生长，以微管组织为中心并显示束分布。然而，随着化合物i2工作液浓度的增加，用i2处理的细胞的微管越来越无序，并且浓度为10μmi2处理的细胞其微管形态发生改变，在阳性对照的秋水仙碱组中发现了类似的趋势即微管的丝状结构完全被破坏。为了进一步研究i2对微管蛋白稳定性的影响，根据微管蛋白装配的低温敏感性，用dmso、浓度为2.5μm、5μm以及10μm的i2与秋水仙碱处理对mda-mb-231细胞，在0℃孵育5分钟后观察i2对微管蛋白稳定性的影响，低温处理导致微管的解聚(微管形态紊乱)。与dmso阴性对照相比，i2处理的细胞中微管的解聚以浓度依赖性方式显着增强。在用秋水仙碱处理的细胞中也观察到这种微管解聚现象，秋水仙碱已被证实为微管蛋白去稳定剂(也称为微管蛋白聚合抑制剂)，总之这些结果表明i2是有效的微管蛋白聚合抑制剂。实施例1制得的其他化合物效果与化合物i2相似，可参照图3。
实施例5
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)进行细胞周期实验。
该实验包括如下步骤：
(1)铺板：按30万/孔的密度，铺于6孔板中；
(2)加药：待细胞过夜孵育12h后，用培养基将化合物i2稀释成2.5μm、5μm以及10μm加药；设立阴性对照组。
(3)孵育：在条件为体积分数5％co2、37℃的培养箱内孵育12h；
(4)收集细胞：用含edta的胰蛋白酶溶液(0.25％)(生产厂家为gibco)消化收集细胞；
(5)固定细胞：制备的单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入体积分数为70％、温度为-20℃的冷乙醇溶液500μl固定2至12h，4℃保存。
(6)pi染色：染色前用pbs洗去固定液，以1000rpm离心5min。加入提前配置好的500μlpi/rnasea染色工作液(临用前将rnasea：pi工作液按1:9体积配成染色工作液)，室温避光30-60min；
(7)上流式细胞仪检测：细胞悬液用70μm细胞筛过滤一次，上机检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞周期实验结果如图4所示，在浓度为10μmi2的作用下，mda-mb-231细胞系g0/g1期的细胞数目均显著减少，大部分细胞被阻滞在g2/m期mda-mb-231细胞系还出现了一个比较明显的sub-g0/g1期，通常这个阶段的细胞代表凋亡的细胞，可能是由于i2对mda-mb-231细胞系作用比较敏感，药物作用比较强，所以导致细胞凋亡比较明显。在中等浓度5μm和低浓度2.5μm的i2作用下，mda-mb-231细胞系的g0/g1期细胞数目比阴性对照组略微少一些，g2/m期细胞数目显示稍微多一些。总之结果表明：高浓度的i2能够阻滞mda-mb-231的细胞周期于g2/m期。其他实施例1筛选得到的化合物效果与化合物(i2)相似，可参照图4。
实施例6
选用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(碧云天；产品编号：c1062s)对化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)进行细胞凋亡实验。
该实验包括如下步骤：
(1)铺板：按25万/孔的密度，铺于6孔板中；
(2)加药：待细胞孵育12h后，用培养基将化合物i2稀释成2.5μm、5μm以及10μm加药；设立阴性对照组。
(3)孵育：在条件为体积分数为5％的co2、37℃的培养箱内孵育24h；
(4)收集细胞：用不含edta胰酶(0.25％)消化收集细胞，原有培养基也需收集；
(5)悬浮细胞：用冰1xbindingbuffer轻柔混悬细胞，并调整细胞浓度为1×106/ml，取0.5ml单细胞悬液至1.5ml离心管；
(6)annexinv-fitc标记：加入1.25μlannexinv-fitc，室温(18-24℃)孵育15min，避光；
(7)pi标记：室温离心(1000g，5min)，去除上清液，加入0.5ml冰1xannexinv-fitc结合液混悬细胞，加入10μlpi，避光置于冰上；
(8)上流式细胞仪检测分析：在上机前补加200μl的1×bindingbuffer。细胞悬液用70μm细胞筛过滤一次，上机检测。
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)对mda-mb-231细胞凋亡实验结果如图5所示。经过流式细胞仪分析的结果如图5的1部分所示，q1象限表示坏死细胞，q2表示晚期凋亡细胞，q3表示正常细胞，q4表示早期凋亡细胞。对于给药10μm组，在mda-mb-231细胞系出现了明显的早期凋亡和晚期凋亡群，对于低浓度给药组，可能凋亡趋势不是很明显。结果表明，高浓度的i2能够促进肿瘤细胞的凋亡。此外，我们用蛋白免疫印迹的方法验证凋亡通路的parp蛋白。如图5所示，随着i2给药剂量的增加，cleaved-parp蛋白含量也随之增加，验证了i2能够促进癌细胞mda-mb-231的凋亡。其他实施例1提供的化合物效果与化合物i2相似，可参照图5。
实施例7
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)进行体外微管蛋白浑浊度实验。
该实验包括如下步骤：
(1)配制缓冲液：配制mesbuffer(1mmgtp，80mmpipes，1mmegta，1mmmgcl2，用pbs溶解，ph7.4)用氢氧化钠调节ph7.4；
(2)配制10mg/mltubulin溶液：取100μlbuffer(含gtp)重悬tubulin粉末(1mg)，冰上放置两分钟后重悬，然后分装每支20μl，于液氮中瞬间冷冻后-80℃保存；
(3)稀释化合物浓度：将化合物i2用mesbuffer稀释成浓度为20μm、10μm或5μm；
(4)稀释微管蛋白溶液浓度：将装有tubulin的ep管在室温水浴中迅速解冻后置冰上，以免微管聚合微管蛋白，用mesbuffer将微管蛋白终浓度稀释为8mg/ml；
(5)按表2所述的体系加入384孔板中(最后加入tubulinprotein)
表2
(6)od值测试：配好体系后直接在条件为37.5℃350nm的酶标仪中测试od值，时间为1h。
体外微管蛋白浑浊度实验结果如图6所示，化合物i2的浓度为10μm时促进体外微管解聚其结果与秋水仙碱一致，并且这与紫杉醇(一种经典的微管稳定剂)的作用形成对比，这就进一步证实i2能够作用于微管蛋白。
其他实施例1提供的化合物效果与化合物i2相似，可参照图6。
实施例8
化合物(r)-1-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-(5-(3-氯苯基)呋喃-2-基)-3-甲基-1,4,5,7-四氢-6h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(i2)进行体外微管蛋白竞争性结合实验：
(1)铺板：按40万/孔的密度，铺于6孔板中；
(2)加药：待细胞孵育12h后，用培养基将化合物i2稀释成200μm、100μm以及50μm加药；设立阴性、阳性和空白对照组；
(3)加ebi：给药12h后，除空白对照外其余每孔直接加10μl的ebi(10mm的母液)；
(4)收集细胞：加ebi1.5h后收集细胞，用细胞刮，刮细胞，然后转移到1.5ml无菌离心管4℃1000rpm离心5min；
(5)洗涤细胞：弃上清，加1mlpbs重悬后，以4℃3000rpm离心5min；
(6)收集蛋白：弃上清，每个ep管加入体积分数为1％的pmsf50μl裂解液混匀后，将所有ep管置于横向振荡器上震荡30s，再在冰上静置5min(重复5-6次)。然后置于离心机中，以4℃，11000rpm，离心30min，最后取上清于-80℃保存；
(7)bca蛋白定量：将待测样品和标准品加入96孔板中，每孔再加入200μl工作液；震荡30s后再37℃孵育30min，最后再将其置于酶标仪测定562nm处的吸光度；
(8)sds-page凝胶电泳：根据bca蛋白的定量结果准备上样样品，98℃变性5min，然后进行电泳电压先为80v20min后调为120v80min；
(9)转膜：负极面在下面依次铺上海绵、一层滤纸、凝胶、pvdf膜、一层滤纸、海绵，制备转膜盒，再将转膜盒置于转膜装置中，倒入转膜液，在冰浴条件或者4℃冰箱中以260ma，转膜70min；
(10)室温封闭：质量分数为5％的脱脂奶粉溶液室温封闭1h，然后用tbst摇床中漂洗3次，每次10min；
(11)孵育一抗：用质量分数为0.5％的脱脂奶粉溶液对一抗β-tubulin和gapdh按照1:500进行稀释，4℃摇床，孵育12h；
(12)孵育二抗：用tbst摇床中漂洗3次，每次10min，然后用1:3000稀释后的羊抗兔(hrp)二抗室温孵育60min；
(13)显影：用tbst洗3次，每次10min，然后用显色液(a液：b液＝1:1，体积比)用显影仪进行显影。
因为ebi与β-微管蛋白的秋水仙碱位点结合，若i2与微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合则会使β-微管蛋白/ebi蛋白复合物减少。因为β-微管蛋白/ebi蛋白复合物迁移速度快于正常β-微管蛋白，所以复合物条带很容易与正常β-微管蛋白条带分离，这就提供了一种简便的方法来鉴定抑制剂是否是微管蛋白秋水仙碱位点结合的抑制剂。体外微管蛋白竞争性结合实验如图7和图8所示，通过蛋白免疫印迹结果图(图7)和蛋白条带灰度值分析结果图(图8)所示，β-微管蛋白/ebi蛋白复合物条带出现在正常β-微管蛋白带下方，并且随着化合物i2浓度的增加，复合物条带的量也随之减少，说明i2与β-微管蛋白的秋水仙碱位点结合，阻止了ebi与β-微管蛋白的秋水仙碱位点结合，所以复合物条带的量减少。结果表明i2与微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合。实施例1提供的其他化合物效果与化合物i2相似，可参照图7和图8。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。