3-羟基-4-吡啶酮
—
环丙沙星耦合物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物及其制备方法和用途。
背景技术：
2.细菌耐药性严重威胁人类健康。作为一种临床上频繁使用的抗菌药，喹诺酮类药物的细菌耐药问题尤其严重，其耐药机制一般认为有：靶酶基因突变、膜通透性降低、主动外排系统和质粒介导耐药。其中，由于细胞膜通透性降低增强了其它耐药机制活性，并且能降低靶点的最终药物浓度，因此显得更为重要。细菌对抗生素产生耐药性的现象给医学界和制药业敲响了警钟，除了对现有有效药物的正确使用外，还需开发新的抗菌药。
3.环丙沙星作为氟喹诺酮类药物具有广谱抗菌活性，优良的药代动力学性质和较少的副作用。然而，目前临床上对环丙沙星的耐药问题较为严重，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌，对其耐药率达到30％～90％。如何提高其抗耐药菌活性，避免耐药问题，成为急需研究的问题。
4.铁是微生物必需的一种重要营养元素，在血液和组织中游离的铁离子浓度仅为10-24
mol/l，细菌生长所需要的铁离子浓度至少为10-6
mol/l。微生物进化出了对fe
3+
有极高特异亲和力(结合常数可达10-52
m～10-20
m)的铁载体(siderophore)和同源膜受体蛋白所组成的铁转运系统。
5.由于细菌对铁载体与fe
3+
所形成的复合物的识别与转运是一个特异、高效的主动过程，因此通过连接链将铁载体与抗菌素结合形成耦合物，利用阴性菌自身的铁转运系统，在细菌主动转运铁载体的同时将抗菌素转运至细菌体内，即―特洛伊木马”(trojan horse)，是一种克服由于阴性菌外膜通透性降低以及产生药物外排泵导致耐药的有效途径。
6.为此，研究人员开发了一些铁载体-抗菌药耦合物。bal30072是由巴塞利亚公司报道的1,3-二羟基-4-吡啶酮—单环β-内酰胺耦合物，对多重β-内酰胺酶稳定，对多重耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌有很好抗菌活性。日本盐野义公司开发的以儿茶酚为铁载体的cefiderocol(头孢地尔)，对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌均具有很强的活性，2019年11月被美国食品和药物管理局批准上市，用于治疗尿路感染。
7.
技术实现要素：
8.本发明要解决的技术问题是提供一种3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物及其制备方法和应用，该3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物能解决环丙沙星的耐药问题。
9.为解决上述技术问题，本发明提供一种3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物，结构通式i为如下：
[0010][0011]
其中，x为
[0012]
作为本发明的3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物的改进，为通式ⅱ或化合物i-4：
[0013]
通式ⅱ：
[0014]
化合物i-4：
[0015]
通式ⅱ具体为以下任一：化合物i-1、化合物i-2、化合物i-3；
[0016]
化合物i-1
[0017]
[0018]
化合物i-2：
[0019]
化合物i-3：
[0020]
本发明还同时提供了上述3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物的互变异构体、光学异构体或其药学上可接受的盐。
[0021]
本发明还同时提供了上述3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物的制备方法：
[0022]
一、通式ⅱ(即化合物i-1、i-2、i-3)的制备方法为包括以下步骤：
[0023]
(1.1)化合物v和化合物vi在无机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，回流反应12
±
1小时，得到化合物vii；
[0024]
化合物v：
[0025]
化合物vi：
[0026]
化合物vii：
[0027]
所述r1为式中的r3为羟基保护基；所述x为所述r2为羧基保护基；
[0028]
(1.2)化合物vii在混合溶剂中，在氢气、钯/碳催化下，经脱除保护基，得到通式ⅱ所述化合物(即化合物i-1～化合物i-3)；
[0029]
二、化合物i-4的制备方法为包括以下步骤：
[0030]
(2.1)化合物viii在有机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，与缩合剂室温反应12
±
1小时，得到化合物ix；
[0031]
化合物viii：
[0032]
化合物ix：
[0033]
上述反应式中，x为
[0034]
r1为
[0035]
r2为离去基团，所述离去基团为：
[0036]
(2.2)化合物ix和环丙沙星在有机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，室温反应12
±
1小时，得到化合物i-4。
[0037]
作为本发明的3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物的制备方法的改进：
[0038]
r3为羟基保护基，保护基为苄基、二苯甲基；
[0039]
r2为羧基保护基，保护基为苄基、二苯甲基。
[0040]
作为本发明的3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物的制备方法的改进：
[0041]
所述步骤(1.1)中，无机碱为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾；非质子极性溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺。
[0042]
所述步骤(1.2)中：混合溶剂可为二氯甲烷/乙醇、二氯甲烷/四氢呋喃；
[0043]
所述步骤(2.1)中：有机碱为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺；缩合剂为n,n
’‑
琥珀酰亚胺碳酸酯、1,1'-羰基二咪唑；非质子极性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃；
[0044]
所述步骤(2.2)中：有机碱可为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺；所述的非质子极性溶剂可为二氯甲烷、四氢呋喃。
[0045]
本发明还同时提供了上述3-羟基-4-吡啶酮—环丙沙星耦合物在制备治疗细菌引起的疾病的药物中的应用。
[0046]
作为本发明应用的改进：所述细菌为革兰氏阴性菌。具体如下：所述细菌为环丙沙星耐药鲍曼不动杆菌(aba)、环丙沙星耐药肺炎克雷伯菌(kp)。
[0047]
在本发明中：
[0048]
本发明的(i-1)、(i-2)和(i-3)化合物可以按照反应式(1)的方法制备：
[0049]
反应式(1)
[0050][0051]
上述反应式(1)中，x为
[0052]
r1为其中r3为羟基保护基，所述保护基例如可以选自：苄基、二苯甲基等；
[0053]
r2为羧基保护基，所述保护基例如可以选自：苄基、二苯甲基等；
[0054]
(a)化合物v和化合物vi在无机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，回流反应12
±
1小时，得到化合物vii；
[0055]
所述的无机碱例如可为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾；所述的非质子极性溶剂例如可为乙腈、二甲基甲酰胺。
[0056]
(b)化合物vii在混合溶剂中，在氢气、钯/碳催化下，经脱除保护基得到化合物i-1～3。所述的混合溶剂可为二氯甲烷/乙醇、二氯甲烷/四氢呋喃；
[0057]
本发明的(i-4)化合物可以按照反应式(2)的方法制备。
[0058]
反应式(2)
[0059][0060]
上述反应式中，x为
[0061]
r1为
[0062]
r2为离去基团，所述离去基团例如可以选自：等；
[0063]
(a)化合物viii在有机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，与缩合剂室温反应12
±
1小时，得到化合物ix；
[0064]
所述的有机碱可为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺；所述的缩合剂可为n,n
’‑
琥珀酰亚胺碳酸酯、1,1'-羰基二咪唑；所述的非质子极性溶剂例如可为二氯甲烷、四氢呋喃。
[0065]
(b)ix和环丙沙星在有机碱条件下，以非质子极性溶剂为溶剂，室温反应12小时得到化合物i-4；
[0066]
所述的有机碱可为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺；所述的非质子极性溶剂可为二氯甲烷、四氢呋喃。
[0067]
本发明的使用方式可参照1,3-二羟基-4-吡啶酮—单环β-内酰胺耦合物。
[0068]
本发明中，通式(i)将环丙沙星分子的哌嗪n与铁载体3-羟基-4-吡啶酮连接在一起，其中3-羟基-4-吡啶酮作为铁载体可以与fe
3+
形成络合物，作为铁的供体被细胞膜上的同源受体所识别，再以主动运输的方式穿过细胞外膜，从而克服耐药菌膜通透性低以及主动外排所引起的耐药性。
[0069]
3-羟基-4-吡啶酮作为一类二齿铁载体，对fe
3+
有很好的选择性和亲和力；同时3-羟基-4-吡啶酮—铁复合物具有较好的体内稳定性和安全性。本发明针对革兰氏阴性菌的耐药问题，将3-羟基-4-吡啶酮铁载体与环丙沙星抗菌素结合形成―特洛伊木马”耦合物，使环丙沙星通过细菌铁载体介导的铁运输途径被主动转运至细胞内，发挥抗菌作用，解决革兰氏阴性菌对环丙沙星的耐药问题。
[0070]
综上，本发明利用―特洛伊木马”策略设计耦合物，即利用细菌对铁载体的特异识别，通过连接链将3-羟基-4-吡啶酮与环丙沙星连接，形成铁载体—抗菌药耦合物，使革兰氏阴性菌特异识别铁载体的同时将抗菌药主动转运至细菌体内，发挥抗菌效果，从而克服阴性菌的耐药。
具体实施方式
[0071]
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。所有实施例中，1h-nmr用浙江大学药学院公共实验平台的bruker 500mhz核磁共振仪测定，化学位移以δ(ppm)表示，tms为内标物；高分辨质谱由agilent1290-hplc-6224质谱联用仪测定；熔点由b
ü
chib-540型熔点仪测定。
[0072]
化合物vi的合成可参考文献(j.med.chem.2013,56,2690-2694)；原料环丙沙星、麦芽酚(ii)购买于上海毕得医药科技有限公司。
[0073]
目标化合物的合成
[0074]
实施例1：1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-吡啶酮基)乙基)氨基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-1)的制备
[0075][0076]
步骤1：苄基麦芽酚(iii)的制备
[0077]
将麦芽酚(ii,50.4g,0.40mol)溶解于80ml乙醇和80ml水的混合溶剂中，在搅拌下依次加入氢氧化钠(17.6g,0.44mol)和苄氯(46.8g,0.37mol)，60℃反应过夜(即，约12小
时)。tlc检测到苄氯反应完全后，旋蒸除去乙醇，剩余混合液用80ml二氯甲烷萃取两次，合并有机层，依次加入50ml 5％的氢氧化钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得到粗品，再用pe和ea重结晶(1:1,v/v)，得到棕色固体iii(62g,79％)。
[0078]
熔点55-57℃；hrms(esi):m/z理论值为c
13h13
o3[m+h]
+
:217.0865,实测值为217.0863。
[0079]
步骤2：1-(2-氨基乙基)-3-苄氧基-2-甲基吡啶-4-酮(iv-1)的制备
[0080]
将iii(4.32g,20mmol),乙二胺(1.26g,21mmol)和氢氧化钠(0.72g,18mmol)溶解于20ml水和20ml乙醇的混合溶剂中，80℃反应1.5小时。tlc检测到iii反应完全后，将反应液旋蒸，除去乙醇，再用50ml二氯甲烷萃取三次，合并有机层，依次用30ml水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，得粗品，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝10:1:0.1，v/v/v，流速为3ml/min)，得到棕色油状物iv-1(2.37g，45％)。
[0081]
hrms(esi):m/z理论值为c
15h19
n2o2[m+h]
+
:259.1447,实测值为259.1447。
[0082]
步骤3：n-(2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-吡啶酮基)乙基)-2-氯乙酰胺(v-1)的制备
[0083]
将iv-1(738.7mg,2.86mmol)和三乙胺(347.1mg,3.43mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，冰浴，反应液冷却至2℃后滴加氯乙酰氯(451.6mg,4.00mmol)，滴加过程中保持温度低于5℃，滴加完后撤去冰浴，缓慢升至室温(升温速度约为1.5℃/min)，从滴加开始至iv-1反应完全共2小时。加入20ml水淬灭反应，有机层依次用20ml水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，得粗品，再用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1-10:1，v/v，流速为3ml/min)得到黄色油状物v-1(802mg,84％)。
[0084]
hrms(esi):m/z理论值为c
17
h2cln2o3[m+h]
+
:335.1162,实测值为335.1159。
[0085]
步骤4：7-(4-(2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-羰基吡啶-乙基)氨基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-甲酸苄酯(vii-1)的制备
[0086]
将v-1(67.0mg,0.2mmol),vi(105.4mg,0.25mmol)溶解于10ml乙腈中，加入碳酸钾(69.1mg,0.5mmol)，回流反应12小时。tlc检测到原料v-1反应完全后，将反应液冷却至室温，抽滤，滤液旋蒸除去乙腈，向剩余物加50ml乙酸乙酯溶解，依次用20ml水、饱和食盐水洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，得粗品，再用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝50:1,v/v，流速为3ml/min)，得到棕色油状物vii-1(53mg,37％)。
[0087]
hrms(esi):m/z理论值为c
41h43
fn5o6[m+h]
+
:720.3197,实测值为720.3196。
[0088]
步骤5：1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-吡啶酮基)乙基)氨基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-1)的制备
[0089]
将vii-1(50.4mg,0.07mmol)溶于10ml二氯甲烷和10ml乙醇的混合溶剂中，加入5mg的质量分数10％钯/碳,先抽真空，再用氢气袋通入氢气，重复三次，使反应瓶中充满氢气。，室温反应3小时(此时反应瓶中仍然存在过量的氢气)。tlc检测到vii-1反应完全后，将反应液用硅藻土抽滤，抽滤所得滤液20ml乙醇洗涤三次，再旋蒸浓缩，得粗品，再用10ml乙醚打浆三次，得到灰色固体i-1(38mg,95％)。
[0090][0091]
熔点158～160℃；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.66(s,1h),8.10(s,1h),7.89(d,j＝13.0hz,1h),7.54
–
7.51(m,2h),6.13(d,j＝7.0hz,1h),4.05(s,2h),3.88
–
3.85(m,1h),3.38
–
3.32(m,6h),3.02
–
3.00(m,2h),2.64
–
2.60(m,4h),2.31(s,3h),1.36
–
1.35(m,2h),1.25
–
1.23(m,2h)；
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ176.77,170.21,169.49,166.40,154.45(d,j＝248.0hz),148.43,145.84,145.63(d,j＝9.0hz),139.64,138.46,129.25,114.04,111.51(d,j＝24.0hz),110.94,107.19,106.70,61.35,52.90,52.23,49.76,38.89,36.35,11.94,8.06；hrms(esi)理论值为c
27h31
fn5o6[m+h]
+
＝540.2258,实测值为540.2255。
[0092]
实施例2：(r)-1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯丙氧基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-2)的制备
[0093][0094]
步骤1：苄基麦芽酚(iii)的制备
[0095]
见实施例1，步骤1。
[0096]
步骤2：(r)-3-(苄氧基)-1-(1-羟基-3-苯丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-4-酮(iv-2)的制备
[0097]
将化合物iii(4.32g,20mmol)和(r)-2-氨基-3-苯丙醇(4.54g,30mmol)按实施例1中步骤2的类似方法制得棕色油状物iv-2(2.60g,65％)。
[0098]
即，具体为：将实施例1步骤2)中的乙二胺改成(r)-2-氨基-3-苯丙醇(4.54g,30mmol)，其余等同于实施例1步骤2)，制得棕色油状物iv-2。
[0099]
hrms(esi):m/z理论值为c
22h24
no3[m+h]
+
:350.1756,实测值为350.1752。
[0100]
步骤3：(r)-2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯基丙基2-氯乙酸酯(v-2)的制备
[0101]
将化合物iv-2(1.0g,2.86mmol)和氯乙酰氯(451.6mg,4.00mmol)按实施例1中步骤3的类似方法制得棕色油状物v-2(2.76g,65％)。
[0102]
即，具体为：将实施例1步骤3)中的iv-1改成化合物iv-2(1.0g,2.86mmol)，其余等
同于实施例1步骤3)，棕色油状物iv-2。
[0103]
hrms(esi):m/z理论值为c
24h25
clno4[m+h]
+
:426.1472，实测值为426.1475。
[0104]
步骤4：(r)-7-(4-(2-(2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯基丙氧基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-甲酸苄酯(vii-2)的制备
[0105]
将化合物v-2(85.2mg,0.2mmol)和vi(105.4mg,0.25mmol)按实施例1中步骤4的类似方法制得棕色油状物vii-2(66mg,41％)。
[0106]
即，具体为：将实施例1步骤4)中的v-1改成化合物v-2(85.2mg,0.2mmol)，其余等同于实施例1步骤4)，得到棕色油状物vii-2。
[0107]
hrms(esi):m/z理论值为c
48h48
fn4o7[m+h]
+
:811.3507,实测值为811.3510。
[0108]
步骤5：(r)-1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯丙氧基)-羰基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-2)的制备
[0109]
将化合物vii-2(56.8mg,0.07mmol)按实施例1中步骤5的类似方法制得灰色固体i-2(41mg,92％)。
[0110]
即，具体为：将实施例1步骤5)中的vii-1改成化合物vii-2(56.8mg,0.07mmol)；其余等同于实施例1步骤5)，得到灰色固体i-2。
[0111]
熔点134～136℃；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.67(s,1h),7.85(d,j＝13.0hz,1h),7.56(d,j＝7.0hz,1h),7.51
–
7.47(m,2h),7.39
–
7.35(m,3h),7.34
–
7.32(m,1h),6.16(d,j＝8.0hz,1h),4.84(d,j＝11.0hz,1h),4.78(d,j＝11.0hz,2h),4.56
–
4.52(m,1h),4.37
–
4.34(m,1h),3.60
–
3.58(m,1h),3.17
–
3.06(m,6h),2.63
–
2.59(m,4h),1.88(s,3h),1.25
–
1.19(m,2h),1.15
–
1.04(m,2h)；hrms(esi)m/z理论值为c
34h36
fn4o7[m+h]
+
＝631.2568,实测值为631.2569。
[0112]
实施例3：(s)-1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-甲基丁氧基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-3)的制备
[0113][0114]
步骤1：苄基麦芽酚(iii)的制备
[0115]
见实施例1，步骤1。
[0116]
步骤2：(s)-3-(苄氧基)-1-(1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)-2-甲基吡啶-4-酮(iv-3)的制备
[0117]
将化合物iii(4.32g,20mmol)和(s)-2-氨基-3-甲基丁醇(3.10g,30mmol)按实施例1中步骤2的类似方法制得棕色油状物iv-3(1.99g,55％)。
[0118]
即，具体为：将实施例1步骤2)中的乙二胺改成(s)-2-氨基-3-甲基丁醇(3.10g,30mmol)，其余等同于实施例1步骤2)，制得棕色油状物iv-3。
[0119]
hrms(esi):m/z理论值为c
18h24
no3[m+h]
+
:302.1756,实测值为302.1756
[0120]
步骤3：(s)-2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-甲基丁基2-氯乙酸酯(v-3)的制备
[0121]
将化合物iv-3(862.0mg,2.86mmol)和氯乙酰氯(451.6mg,4.00mmol)按实施例1中步骤3的类似方法制得棕色油状物v-3(1.85g,56％)。
[0122]
即，具体为：将实施例1步骤3)中的iv-1改成化合物iv-3(862.0mg,2.86mmol)，其余等同于实施例1步骤3)，棕色油状物v-3。
[0123]
hrms(esi):m/z理论值为c
20h25
clno4[m+h]
+
:378.1472,实测值为378.1474
[0124]
步骤4：(s)-7-(4-(2-(2-(3-(苄氧基)-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-甲基丁氧基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-甲酸苄酯(vii-3)的制备
[0125]
将化合物v-3(75.6mg,0.2mmol)和vi(105.4mg,0.25mmol)按实施例1中步骤4的类似方法制得棕色油状物vii-3(67mg,44％)。
[0126]
即，具体为：将实施例1步骤4)中的v-1改成化合物v-3(75.6mg,0.2mmol)，其余等同于实施例1步骤4)，得到棕色油状物vii-3。
[0127]
hrms(esi):m/z理论值为c
44h48
fn4o7[m+h]
+
:763.3507,实测值为763.3506
[0128]
步骤5：(s)-1-环丙基-6-氟-7-(4-(2-(2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-甲基丁氧基)-2-羰基乙基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(i-3)的制备
[0129]
将化合物vii-3(53.4mg,0.07mmol)按实施例1中步骤5的类似方法制得棕色固体i-3(34mg,84％)。
[0130]
即，具体为：将实施例1步骤5)中的vii-1改成化合物vii-3(53.4mg,0.07mmol)，其余等同于实施例1步骤5)，得到棕色固体i-3。
[0131]
熔点143～144℃；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.67(s,1h),7.89(d,j＝13.0hz,1h),7.73(d,j＝7.5hz,1h),7.55(d,j＝7.0hz,1h),6.21(d,j＝7.5hz,1h),4.53
–
4.50(m,1h),4.45
–
4.41(m,2h),3.88
–
3.83(m,1h),3.29
–
3.17(m,6h),2.58
–
2.54(m,4h),2.32(s,3h),1.36
–
1.31(m,2h),1.26
–
1.22(m,1h),1.21
–
1.14(m,2h),1.09
–
1.03(m,3h),0.70
–
0.67(m,3h)；
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ171.75,171.59,169.55,164.56,153.56(d,j＝245.0hz),148.37,144.37,143.82(d,j＝10.0hz),138.02,137.49,136.69,135.34,121.92,111.73(d,j＝23.0hz),108.82,106.28,71.73,65.22,63.97,51.64,49.42,34.82,29.94,19.23,18.79,7.49；hrms(esi)m/z理论值为c
30h36
fn4o7[m+h]
+
＝583.2568,found583.2565.
[0132]
实施例4：(s)-1-环丙基-6-氟-7-(4-((2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯丙氧基)羰基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-甲酸(i-4)的制备
[0133][0134]
步骤1：(s)-3-羟基-1-(1-羟基-3-苯基-2-丙基)-2-甲基吡啶-4-酮盐酸盐(viii)的制备将麦芽酚(ii,189.2mg,1.5mmol),(r)-2-氨基-3-苯丙醇(251.0mg,1.66mmol)和硼酸(92.7mg,1.5mmol)加入50ml水中，加热回流。tlc检测到麦芽酚反应完全后，将反应液冷却至室温，用40％氢氧化钠溶液调ph为8.5，加100ml二氯甲烷萃取两次，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，剩余物加6m盐酸溶液调至ph＝1，40℃加热溶解，再缓慢冷却至冰浴，搅拌至固体析出。抽滤，滤饼用10ml水洗涤，干燥，再用正丁醇和乙腈(3：1，v/v)重结晶，得到黄色固体viii(154mg,61％)。
[0135]
熔点186-187℃；hrms(esi):m/z理论值为c8h
12
no3[m+h]
+
:169.0739,实测值为169.0736.
[0136]
步骤2：(s)-2,5-二氧吡咯烷-1-基(2-(3-羟基-2-甲基-4-氧吡啶-1(4h)-基)-3-苯丙基)碳酸酯(ix)的制备
[0137]
将viii(346.7mg，1mmol)溶解于30ml四氢呋喃，加入三乙胺(556.6mg,5.5mmol)和n,n
’‑
琥珀酰亚胺碳酸酯(384.3mg,1.5mmol)，室温搅拌2小时，tlc检测到viii反应完全后，旋蒸浓缩，得到ix的粗品直接投下一步。
[0138]
步骤3：(s)-1-环丙基-6-氟-7-(4-((2-(3-羟基-2-甲基-4-羰基吡啶-1-基)-3-苯丙氧基)羰基)哌嗪-1-基)-4-羰基-1,4-二氢喹啉-3-甲酸(i-4)的制备
[0139]
将ix的粗品加10ml二氯甲烷溶解，再加入环丙沙星(397.7mg,1.2mmol)和三乙胺(404.8mg，4mmol)，室温搅拌两小时(此时tlc检测到ix消失)，加20ml水淬灭反应。分液，水层用50ml二氯甲烷萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，粗品用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1,流速为3ml/min),得到粉色固体(400mg,65％)。
[0140]
熔点136-138℃；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.66(s,1h),7.96(d,j＝7.5hz,1h),7.89(d,j＝13.0hz,1h),7.52(d,j＝7.5hz,1h),7.28
–
7.22(m,2h),7.20
–
7.17(m,3h),6.21(d,j＝7.5hz,1h),4.86
–
4.82(m,1h),4.54
–
4.45(m,1h),4.42
–
4.38(m,1h),3.87
–
3.84(m,1h),3.51
–
3.47(m,4h),3.27
–
3.06(m,6h),2.01(s,3h),1.35
–
1.30(m,2h),1.20
–
1.15(m,2h)；13c nmr(125mhz,dmso-d6)δ176.78,169.34,166.40,154.41(d,j＝249.0hz),154.17,148.47,145.38(d,j＝10.0hz),145.04,139.55,137.05,134.42,130.05,129.44,128.94,127.27,119.43(d,j＝8.0hz),111.72,111.47(d,j＝24.0hz),107.32,107.20,66.52,
60.22,43.62,43.59,36.56,36.36,12.03,8.05；hrms(esi)m/z理论值为c
33h34
fn4o7[m+h]
+
＝617.2412,实测值为617.2410.
[0141]
测试例1、化合物的体外抗耐药阴性菌活性实验
[0142]
1.1试验菌株
[0143]
体外抗菌活性测试所选用的受试临床分离菌株为：环丙沙星耐药鲍曼不动杆菌(aba)、环丙沙星耐药肺炎克雷伯菌(kp)，参见：永康地区耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药表型及分子分型分析.浙江医学2022,44(10),1063-1066；浙江省永康地区多重耐药鲍曼不动菌的分子分型研究.中国预防医学杂志2015,16(5),379-383。
[0144]
菌种来源：该实验所用菌株为2021年05月在浙江地区收集的临床分离致病菌。每株细菌在实验前经过琼脂平板划单菌落分纯，37℃隔夜新鲜培养的菌体适当稀释用于实验。
[0145]
1.2体外抗菌试验方法
[0146]
采用美国临床和实验室标准协会(clsi)抗菌药物敏感性试验操作规程所推荐的微量肉汤稀释法来测定各受试样品，对所试菌株在正常mhb培养基和缺铁mhb培养基中测mic值。
[0147]
1.3实验步骤
[0148]
1.3.1在正常培养基中测mic值
[0149]
1.3.1.1mhb液体培养基配置
[0150]
称取mhb干粉11g于500ml超纯水中，搅拌溶解，放入高压蒸汽灭菌锅(121℃，20min)，灭菌完成后取出，待冷却后放置37℃恒温培养箱中备用。
[0151]
1.3.1.2药物储备液的准备
[0152]
称取目标化合物或阳性对照药3μmol溶于3mldmso中，配成1mm的化合物溶液。加2mlph8.0的tris-hcl缓冲液，再加1mlfecl3溶液(1mm)，摇匀，配置成药物储备液(0.5mm)。
[0153]
1.3.1.3菌悬液配制
[0154]
取出-70℃冻存的菌株，分区接种于血琼脂平板上(ba)上，在35℃孵化箱中培养16-24h，待长出单个菌落后备用。实验前用无菌接种环挑取单个菌落于0.45％的生理盐水中，并调成菌液浓度为0.5麦氏浊度(1.0
×
108cfu/ml)。
[0155]
1.3.1.4微量肉汤稀释法药敏实验
[0156]
吸取药物储备液512μl,用mhb培养液稀释至1ml,配成浓度为256μm肉汤工作液。于洁净工作台中，
[0157]
①
将96孔板首孔分别加入200μl稀释后的药液，第二至十孔分别加入100μl的mhb肉汤，第十一孔加入200μl菌液作为菌液阴性对照，第十二孔加入200μl mhb肉汤作为阳性对照。
[0158]
②
用八通道移液枪从第一列吸取100μl抗菌药物于第二列，混匀，然后从第二列吸取100μl至第三列，混匀。以此二倍梯度稀释法直到第十列混匀后吸出100μl弃去。
[0159]
③
然后在第一至十列再分别加100μl的菌悬液，此时第一至十列的化合物最终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μm。
[0160]
④
将96孔板做好标记放置于35℃培养箱培养16～24h观察结果。菌液阴性对照孔显示浑浊，阳性对照孔显示清亮，质控在规定范围内，以肉眼观察无细菌生长的最低浓度即
为化合物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，mic)。
[0161]
1.3.2在缺铁培养基中测mic值
[0162]
通过将2,2
’‑
联吡啶加入正常培养基中，该化合物能鳌合培养基中的铁。缺铁的环境下，细菌分泌大量的铁载体与2,2
’‑
联吡啶竞争培养基中的铁，细菌独特的摄铁途径得以激发，有利于铁载体—抗菌药耦合物发挥抗菌作用。此外，在人和动物体内，铁元素被各种蛋白络合，导致可被细菌利用的游离铁浓度极低，加入2,2
’‑
联吡啶的缺铁培养基正是对体内缺铁环境的模拟，缺铁培养基条件能更有效地反映化合物的抗菌作用的效果。
[0163]
1.3.2.1mhb缺铁培养基配置
[0164]
称取mhb干粉11g于500ml超纯水中，搅拌溶解，放入高压蒸汽灭菌锅(121℃，20min)，灭菌完成后取出，待冷却后放置37℃恒温培养箱中备用。
[0165]
1.3.2.2药物储备液的准备
[0166]
称取目标化合物或阳性对照药3μmol溶于3mldmso中，配成1mm的化合物溶液。加2mlph8.0的tris-hcl缓冲液，再加1mlfecl3溶液(1mm)，摇匀，配置成药物储备液(0.5mm)。
[0167]
1.3.2.3菌悬液配制
[0168]
取出-70℃冻存的菌株，分区接种于血琼脂平板上(ba)上，在35℃孵化箱中培养16-24h，待长出单个菌落后备用。实验前用无菌接种环挑取单个菌落于0.45％的生理盐水中，并调成菌液浓度为0.5麦氏浊度(1.0
×
108cfu/ml)。
[0169]
1.3.2.4微量肉汤稀释法药敏实验
[0170]
吸取药物储备液512μl,用mhb培养液稀释至1ml,配成浓度为256μm肉汤工作液。于洁净工作台中，
[0171]
①
将96孔板首孔分别加入200μl稀释后的药液，第二至十孔分别加入100μl的缺铁mhb肉汤，第十一孔加入200μl菌液作为菌液阴性对照，第十二孔加入200μl缺铁mhb肉汤作为阳性对照。
[0172]
②
用八通道移液枪从第一列吸取100μl抗菌药物于第二列，混匀，然后从第二列吸取100μl至第三列，混匀。以此二倍梯度稀释法直到第十列混匀后吸出100μl弃去。
[0173]
③
然后在第一至十列再分别加100μl的菌悬液，此时第一至十列的化合物最终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μm。
[0174]
④
将96孔板做好标记放置于35℃培养箱培养16～24h观察结果。菌液阴性对照孔显示浑浊，阳性对照孔显示清亮，质控在规定范围内，以肉眼观察无细菌生长的最低浓度即为化合物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，mic)。
[0175]
1.4化合物的体外抗耐药阴性菌实验结果
[0176]
表1化合物抗耐药阴性菌mic值(单位：μm)
[0177][0178]
表中数据显示，在正常条件下，本发明化合物对耐药肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌具有中等抗菌活性，与环丙沙星相当或稍弱。缺铁培养基模拟体内感染缺铁环境，能更有效地反应化合物的抗菌活性。在缺铁条件下，化合物i-1对耐药肺炎克雷伯菌的抗菌活性比环丙沙星增强一倍，化合物i-2，i-3和i-4对耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性比环丙沙星增强一倍。
[0179]
综上，本发明化合物具有新颖的化学结构，在缺铁条件下对环丙沙星耐药菌的抗菌活性提升，有望开发为药物治疗耐药革兰氏阴性菌引起的感染性疾病。
[0180]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。