菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度最高， F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有发现交联。CyDye NHS标记抗体在pH (8。5～9。4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7。0几乎不反应。我们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase(GST)多克隆抗体发现用1:1，5:1，10:1 和 20:1标记时得到的F/P值分别是 0。28:1，1。16:1，2。3:1和4。6:1。
操作步骤：
一、 水溶性Cy3 NHS ester标记anti-GST多克隆抗体
市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或带氨基的缓冲液会影响标记，在标记前需纯化。
1。 在1 L 0。15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0。5 mL at3 mg/mL)，常温透析4小时。
2。 在4°C用新鲜的1 L 0。15 MNaCl 溶液再透析过夜。
3。 第二天用1 L 0。1 M NaHCO3 (pH 8。3)透析4小时。
4。 用0。22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
5。 用0。1 M NaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 （IgGantibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm)。
6。 用DMSO配置Cy3 NHS (MW765。95) 溶液浓度为10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。
7。 用1 L 0。15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。
8。 在4°C用新鲜的1 L 0。15 MNaCl 溶液再避光透析过夜。
9。 用1 L of 0。01 M PBS/ 0。01% ****溶液常温避光透析4小时， 在4°C常温避光再次透析过夜。
10。 用0。22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
11。 用0。01 M PBS/0。01 % ****整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm（蛋白）和552nm（Cy）处的紫外可见吸光度。
12。 产品冷冻干燥成粉末或在0。01 M PBS/ 0。01% ****溶液中，-20℃避光储存。
F/P计算：
Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000
M-1cm-1；不同蛋白的摩尔吸光系数不一样；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm处的8%。
按以下公式计算F/P值。
[Cy3] = A552/150000
[antibody] = {A280 - (0。08×A552)}/170000
F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1。13×A552}/{A280 - (0。08×A552)}
二、 水溶性Cy5 NHS ester标记 (D-ser2)-leucineenkephalin
1。 Cy5 NHS 1。0 mg溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalinacetate(YSGFLT，0。75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）
2。 然后加入15 μL，常温避光搅拌反应混合物过夜。
3。 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 μL，30分钟梯度洗脱。从0。1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0。1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相）
4。 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5。 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存；必要时可用质谱表征。
6。 CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存。
F/P计算：
Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为170000M-1cm-1；Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。
[Cy5 dye] = (A650)/250 000
[peptide] =[A280 -(0。05×A650)]/170000
F/P final= [dye]/[peptide]= {0。68×A650}/{A280 - (0。05×A650)}
三、 水溶性Sulfo Cy3 NHS ester 标记OLIGO
氨基封端的OLIGO可以标记CyDye SE，但是非常困难；标记前因为OILGO经水脱保护，请务必洗涤掉所有的残余。然后将样品真空干燥；然后溶于0。25ml 的0。5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脱盐，用5。0 mM borate 缓冲液平衡到pH=8。0，然后用缓冲液冲下OLIGO。
然后浓缩至干的样品溶于0。1M carbonate buffer (pH 8。5-9。0)；在0。5mL碳酸缓冲液中30nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经Sephadex G-50或RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。
注意：Oligonucleotides和oligopeptides由于太小经常会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜，而无法标记。
四、 小动物活体成像领域的应用
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域，在研究细胞行为，药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以Caliper 和Xengon 仪器为代表）和荧光成像（以KODAK 和CRI 仪器为代表）。
1、荧光成像的推荐步骤：
（1） SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄，18～20克，实验前24 h 自由进食、饮水。
（2） 于实验前将裸鼠腹腔内注射麻醉药物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物最好溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有时DMSO 200uL能把小鼠杀死）稀释后，于裸鼠尾静脉注射200μL（浓度0。5 mg/mL），最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化。每5min记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。
（3） Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通，发射波长790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm，扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4～6 小时，快的只有30 分钟；如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7 标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。器官切片观察：将解剖的器官迅速放置固定4 小时以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。
2、荧光成像常见问题
（1） 什么类型的小鼠适合活体成像？
毛发对光有散射，建议用裸鼠。
（2） 给裸鼠注射的最佳和最大注射试剂体积？
试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同，下面是体重25g 的裸鼠注射量。
 （3） 注射针头的尺寸是多少？
推荐使用具有固定针头的28～32 号结核菌素或胰岛素注射器（0。3 或1mL）
（4） 肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体？
推荐起始用量50μg 来优化最佳用量。
（5） 未标记的染料在老鼠体内如何代谢？
未标记水溶性染料通过膀胱排泄，静脉注射后最快能在3min 检测到膀胱内的荧光信号。
（6） 注射后多长时间开始成像？
成像时间和成像持续时间与注射试剂有关。血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小
时。注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时，而后才成像并持续成像数天。
（7） Solar Fluor dyes 的荧光寿命是多少？
Solar Fluor 647 在20°C 水中τ＝1 ns
Solar Fluor 680 在20°C 水中τ＝1。2 ns
Solar Fluor 750 在20°C 水中τ＝0。7 ns
稳定性与储存：
未开封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液现配现用不能储存。任何溶解后的CyDye NHS粉末最好立即使用；绝对无水的DMSO溶液-20°C保存最多2个星期。