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常见亲脂性细胞膜染料DiO, Dil, DiR, Did光谱图和实验操作流程

作者:常见亲脂性细胞膜染料DiO, Dil, DiR, Did光谱图和实验操作流程 发布时间:2022-10-18 09:33:52 次浏览

常见亲脂性细胞膜染料DiO, Dil, DiR, Did光谱图和实验操作流程
Di 属于长链二烷基碳菁类染料,因其独特的结构使其具有极强亲脂性,可与脂溶性生物结构结合,在一定浓度下,可以对细胞膜进行完全染色。Di 染料被激发后具有很高的淬灭系数和激发态寿命,在细胞与组织定位示踪中起到了极大作用。
DiD(CAS:127274-91-3),DiO(CAS:34215-57-1),DiI(CAS:41085-99-8),DiR(CAS:100068-60-8)和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料,可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强,这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色,这类染料在整个细胞膜上扩散,佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显:DiI(橙色荧光),DiO(绿色荧光),DiD(红色荧光)和 DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发,有着比DiI更长的激发波长和发射波长,在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织,在活体成像中用来示踪。
常见的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR,在被激发后形成不同颜色的荧光 (如图 1)。
图 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光谱图
DiO 染色为例,简要抛出体外实验步骤
a)接种适量数目的细胞,37°C 培养过夜。
b)去除培养基,离心收集细胞,加入 PBS 洗涤 2-3 次,每次 5 分钟。
c)加入对应浓度 DiO 工作液 (5-10 μM),室温孵育 30 分钟。
d)400 g,4℃ 离心 3-4 分钟,弃去上清。再次加入 PBS 洗涤细胞 2-3 次,以充分去除未进入细胞内的DiO。
f)用无血清培养基或 PBS 重悬细胞后,在荧光显微镜或流式细胞仪下检测。
图 2. 实验流程简图
DiO
DiO 为绿色荧光染料,激发/发射波长为 483/501 nM,DiO 常被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织。(但相较其他三种染料,DiO 染料荧光强度较弱,对于某些固定的组织切片染色效果略差)。
Xin Li 等人研究了 CPCs (心脏祖细胞) 衍生的外泌体 (CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信号通路来减少病毒性心肌炎的细胞凋亡。研究人员用 DiO 对 CPCs-Ex 进行标记 (Dio 可通过选择性分割被纳入细胞膜),评估 H9C2 细胞对 CPCs-Ex 的体外摄取,荧光显微镜观察发现 H9C2 细胞的每个细胞质均包含荧光信号 (图 2),并减少 H9C2 细胞的凋亡,确定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染细胞中的抗凋亡作用。
图 3. H9C2 细胞摄取 DiO 标记的外泌体[1]
DiI
DiI 为橙红色荧光染料,激发/发射波长为 551/569 nM,DiI 被用于正向或逆向示踪各类细胞或组织,荧光信号强度高于 DiO,在进入细胞膜时,其荧光信号会被大幅度放大。
如图 4 所示,Dil 染料标记外泌体,然后与目标细胞共培养。使用共聚焦显微镜捕捉 HOS 细胞对 Dil 标记外泌体的摄取,其中被标记的外泌体发出特异性橙红色荧光。
图 4. HOS 和 MG63 细胞摄取红色荧光染料 Dil 标记的 hBMSC-Exos[2]
DiD
DiD 为一种红色荧光染料,激发/发射波长为 646/663 nM,DiD 荧光信号高、不易淬灭、自身荧光干扰低,不仅用于细胞/组织染色,小动物活体成像中是最常用的。
图 5. DiD 标记 EV-RBD 在小鼠体内分布情况亡[3]
DiR
DiR 是一种近红外染料,激发/发射波长为 754/778 nm,用于正向或逆向示踪各类细胞或组织,与 DiD 一样,DiR 自身荧光背景较低,也被用在活体成像中。
今天的介绍暂时就到这里了,小伙伴们看完是否有小小收获?
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